Разработка новых средств химиотерапии гормонорезистентного рака предстательной железы
А.В. Соснов, Н.Ю. Анисимова, М.В. Киселевский,
А.А. Gakh, М.Ю. Красавин, К.А. Руфанов,
Р.Н. Карапетян, С.В. Садовников, И.Н. Станьков
ЗАО Исследовательский институт химического разнообразия, МО, Химки; РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва; Oak Ridge National Laboratory (ORNL) DOE, США
ГРРПЖ, развивающийся у части пациентов, представляет крайне опасную и трудно поддающуюся стабилизации форму РПЖ.
Материалы и методы
В рамках совместного проекта ИИХР, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и ORNL нами проведена комплексная научноисследовательская работа в области разработки новых потенциальных средств ХТ ГРРПЖ. Основная часть работы включала выбор, синтез и исследование около 6000 ранее не изученных низкомолекулярных веществ, относящихся к 150 различным хемотипам. Основные усилия были направлены на исследование in vitro и последующую модификацию гетероциклических органических соединений и включали 3 основные стадии:
1) компьютерный скрининг реально доступных для синтеза низкомолекулярных соединений;
2) комбинаторный синтез и физико-химический анализ выбранных соединений;
3) высокопроизводительное биотестирование, обработку данных, оценку связи структура-активность и оптимизацию с целью увеличения анти-пролиферативной активности и специфичности веществ.
Для первичного исследования антипролиферативной активности веществ и определения значения IC50 была использована высокопроизводительная роботизированная система. Тестирование проведено с применением в основном 2-клеточных линий ГРРПЖ – PC-3 и DU145. Селективность веществ в отношении именно раковых клеток определялась в тестах цитотоксичности с использованием медленно растущих клеток гепатокарциномы человека HepG2. Схема исследования представлена на рис.1.
Данный подход позволил разработать более 100 новых высокоактивных веществ, относящихся к 11 хемотипам. Активность данных соединений in vitro находится в интервале 5 nM < IC50 < 1 uM. Некоторые из исследованных веществ описаны в созданной нами открытой сетевой базе данных проекта: http://discovery.chem.iihr.ru/InhData/search.htm
Также были исследованы наиболее интересные природные вещества из пищевых растений и их синтетические производные. Показана высокая активность хелатных комплексов куркумина с некоторыми биоактивными металлами (IC50 = 100 nM). В процессе исследования производных и аналогов резвератрола было обнаружено, что его природный метаболит дигидрорезвератрол обладает способностью интенсивно активировать пролиферацию некоторых типов опухолевых клеток (MCF7, PC-3, DU145) в низких концентрациях, причем достоверная активация клеток MCF7 происходит на уровне пикомолярных концентраций (рис. 2).
В концентрациях выше микромолярных данное вещество подобно резвератролу подавляет пролиферацию практически всех исследованных нами типов раковых клеток. Показано, что пролиферативный эффект дигидрорезвератрола может быть купирован введением в среду резвератрола или тамоксифена в более высоких концентрациях.
Результаты
Проведенный нами анализ некоторых натуральных продуктов, включая около 50 типов вин, показал, что дигидрорезвератрол практически всегда присутствует в продуктах, содержащих резвератрол. Его концентрация в винах приблизительно на порядок ниже суммарной концентрации транс- и цис-изомеров резвератрола, однако бывают и исключения.
Также были исследованы ковалентные и нековалентные конъюгаты известных низкомолекулярных лекарств и других активных ингибиторов пролиферации раковых клеток.
Для создания ковалентных конъюгатов (пролекарств) применяли производные стильбена, например комбретастатин А4 и его активные аналоги. Показано, что данный подход позволяет создавать патентночистые высокоактивные соединения.
Для создания нековалентных конъюгатов были использованы натуральные и полусинтетические циклодекстрины (ЦД). Была создана серия нанокомпозиций, включающая биологически активные соединения и ЦД в разных молярных соотношениях лекарство–ЦД, исследована их антипролиферативная активность в отношении ГРРПЖ. Также была создана нанокомпозиция, содержащая ЦД и рекомбинантный ИЛ-2 в низкой концентрации для генерации лимфокинактивированных киллеров (ЛАК). Результаты исследований учитывались в МТТ-тесте и с помощью метода проточной цитометрии.
В ряде случаев применение нанокомпозиций с ЦД позволяло увеличить антипролиферативную активность низкомолекулярных веществ в 2−200 раз. Однако были отмечены эффекты снижения активности действующих соединений, а также амбивалентный эффект применения композиции. Установлено, что молярное соотношение вещество–ЦД играет существенную роль в интенсивности проявления эффекта нанокомпозиции.
Тот же подход был использован при создании нового способа генерации ЛАК. Для этих целей мононуклеарные лейкоциты крови коинкубировали с нанокомпозицией, включающей ЦД и ИЛ-2 в низкой концентрации (50 ME). При применении этого подхода был зафиксирован уровень НК-активности, аналогичный применению высокой концентрации ИЛ-2 (500 ME). Клетки, активированные данной нанокомпозицией, продемонстрировали существенную цитотоксическую активность против К-562, PC-3 и DU145. В отличие от ИЛ-2, созданная нами нанокомпозиция активировала как лимфоциты, так и макрофаги. Результатом применения данного подхода стала генерация популяции, содержащей CD16+/CD56+-клетки (натуральные киллеры), CD3+/CD16+-клетки (натуральные киллерные Т-клетки и зрелые дендритные клетки − CD80+/CD83+), экспрессирующие HLA-DR.
Выводы
Результаты исследования описаны в 3 международных патентных заявках, 1 патенте РФ,
а также представлены в более чем 30 научных публикациях и докладах на международных конференциях.
Большая часть данных работ выполнена при финансовой поддержке программы GIPP в рамках проекта Министерства энергетики США Discovery Chemistry Project и при участии Международного научно-технического центра (Проект 3548р).
Материалы VI Конгресса Российского общества Онкоурологов
