Золотое Здоровье » Статьи о мужском здоровье » Мужское бесплодие »

Стволовые клетки и их использование в современной клинической практике

Камалов А.А., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А.
ФГУ НИИ урологии Росмедтехнологий, директор профессор О.И. Аполихин

   Большинство клеток человеческого организма имеют узкую специализацию, т.е. соответствуют и определяют специфические функции органов и тканей, и в свою очередь определяются этими функциями. В организме человека таких клеток более 350 видов. В процессе эмбриогенеза, особенно на ранних стадиях, клетки организма еще не имеют узкой специализации, но способны к дифференцировке и способны быть родоначальниками различных видов клеток. Такие клетки называются стволовыми. Эти клетки являются универсальным строительным материалом, из которого при соответствующем функциональном и анатомическом окружении, при протекании специфических биохимических реакций, дифференцируются любые клетки нашего организма [1].

   Стволовые клетки – это отдельные клетки или группа клеток-предшественников, обладающих способностью к самообновлению и дифференцировке в специализированные ткани.

   Эти клетки, и среди них, прежде всего эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), оказались перспективными для решения не только многих фундаментальных вопросов биологии и генетики развития, но и в практической биотехнологии, генной терапии, трансплантологии, гематологии, ветеринарии, фармакотоксикологии, при тестировании лекарств и в других областях. Если ЭСК выращивать в культуре, in vitro, из них возникают обычные стволовые (недифференцированные, самообновляющиеся) клетки (СК), которые способны трансформироваться в разные типы клеток и тканей (кроветворные, половые, мышечные, нервные и др.) и длительное время сохраняться с помощью криоконсервации [2].

   Отношение к проблеме изучения стволовых клеток во всем мире неоднозначное. Общественное мнение стран мира часто расходится от официального разрешения по изучению данной проблемы до полного запрета, вплоть до угрозы уголовного наказания. В Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации говорится: "Интересы и благо отдельного человека должны превалировать над интересами общества и науки". В 18-й статье Конвенции о правах человека и биомедицине о таких исследованиях сказано следующее:

   Во Франции рекомендуется относиться с уважением к эмбриону от момента его зачатия. В Великобритании, Канаде и Австралии, разработана система законодательных актов, регулирующая и контролирующая исследования с эмбрионами и эмбриональными тканями. В США подобные работы проводятся только в частных фирмах, так как конгресс запрещает использовать для этой цели федеральные средства [2]. В ряде стран разрешаются исследования лишь на тех эмбрионах человека, которые не востребованы после экстракорпорального оплодотворения, а также получение стволовых клеток только от криоконсервированных или переданных их "владельцами" эмбрионов человека при соблюдении соответствующих правил [2].

   Руководства и принципы исследований на эмбрионах человека детально обсуждаются группой по этике в науке и новых технологиях Европейской комиссии, а также рабочими группами Руководящего комитета по биоэтике в Совете Европы. Эти группы разрабатывают дополнительные протоколы к Конвенции о правах человека и биомедицине [2].

   В России работы со стволовыми клетками регулируются "Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан", где предусмотрено создание регулирующих этических комитетов, Временной инструкцией о порядке исследований в области клеточных технологий и их использовании в учреждениях здравоохранения, разработанной Экспертным Советом Минздрава России 18.04.2002 г., а также законом Российской Федерации "О трансплантации органов и (или) тканей человека" (1992г.) и Приказом Минздрава РФ от 25 июля 2003 г. N 325
"О развитии клеточных технологий в Российской Федерации" [2,3]. Кроме того, в 2002 г принята отраслевая программа «Новые клеточные технологии – медицине», рассчитанная на 8 лет, целью которой является разработка и широкое применение в России наукоемких и эффективных биомедицинских технологий, основанных на фундаментальных и прикладных исследованиях стволовых клеток и создания необходимой для этого инфраструктуры [7].

   В исследовательских целях разрешено использование эмбрионального материала человека с момента оплодотворения до 8-й недели включительно. При использовании абортивного материала должны соблюдаться условия контроля возраста эмбрионов, а эмбриональные клетки должны извлекаться из неповрежденных зародышей. Использование в исследовательских целях жидкостей, оболочек, пуповинных и плацентарных тканей после рождения. ребенка, а впоследствии применение выделенных клеток в терапевтической практике разрешено только при условии оформления письменного разрешения Минздрава России. Работа с донорским материалом должна проводиться по правилам принятым при переливании крови и ее компонентов [3].

   В литературе используются две классификации стволовых клеток: а) по источнику происхождения клеток (эмбриональные, фетальные, клетки костного мозга, клетки пуповинной крови, стволовые клетки тканей взрослого организма и.т.д.) и б) по способности к дифференцировке: тотипотентные, образующие клетки любых типов, плюрипотентные, образующие клетки многих типов, но не всех, мультипотентные, образующие клетки нескольких типов и унипотентные – образующие только один тип клеток [2].

   Термин «стволовая клетка» введен в биологию русским гистологом А.А.Максимовым в 1908 году при исследовании процессов кроветворения. Он высказал гипотезу о существовании недифференцированных клеток, сохраняющихся в организме пожизненно, которые могли превращаться в лимфоциты и другие специализированные клетки соединительной ткани и крови. Клетки были названы по аналогии со строением дерева, т.е. ветками, растущими от одного ствола. Тогда в практической медицине широко использовалось направление, ставящее целью омоложение человеческого организма. Литературный герой М. Булгакова профессор Ф.Ф. Преображенский с этой целью пересаживал «яишники обезьяны», а апофеозом романа явилась пересадка животному человеческого гипофиза. Следует отметить, что подобная практика действительно применялась рядом клиник в 20-30-х годах прошлого столетия. В частности, русский хирург Воронцов в Париже с целью омоложения пересаживал пациентам половые железы обезьян. Отмечено было выраженное омолаживающее действие от подобных вмешательств с кратковременным эффектом в течение нескольких недель. Каждая последующая операция давала менее выраженный эффект и в итоге наступало скорое старение пациента. В 1997 году журнал «Тайм» поместил об этом специальную статью [33]. В СССР академик В.Ф.Филатов с 1933 по 1969 г успешно разрабатывал методы получения тканевых препаратов для стимуляции биосинтетических и обменных процессов и активации репаративных реакций в клетках стареющего организма [4]. В 1931 году Пауль Ниханс в Швейцарии опубликовал ряд работ и основал клинику, занимающуюся трансплантацией тканей, содержащих живые клетки. Использовалась пересадка паращитовидных желез крупного рогатого скота, как сообщалось, с положительным эффектом. Любопытно, что он трактовал результаты трансплантаций не как эффект воздействия гормонов (или стимулирующего воздействия трансплантированных активных факторов), а как восстановление в организме больного адекватных функций, которые выполняли поврежденные и удаленные при выполнении операции клетки. Клиника Ниханса существует по настоящее время, и с 1931 года в ней выполнено боле 50000 операций [1,5,32].

   Наиболее активно трансплантация органов и тканей стала развиваться с 50-60-х годов, когда начались работы по лечению пациентов, имеющих тяжелые заболевания крови. В середине 50-х E.Thomas сделал пересадку костного мозга от здоровой сестры близнеца девочке, перенесшей радиационное лечение острой анемии с положительным результатом. В 1961 году была сделана первая пересадка фетальных гематогенных клеточных предшественников двум пациентам с апластической анемией. Начиная с 1970 года стали появляться работы об успешных трансплантациях островков Лангерганса крысам с экспериментальным диабетом [5]. В 1975 году осуществлена первая успешная пересадка фетальных стволовых клеток печени при врожденном синдроме дефицита островков Лангерганса. В СССР А.Я. Фриденштейн опубликовал ряд работ, посвященных изучению плюрипотентных стволовых клеток костного мозга и процессов их дифференцировки, получивших международное признание. В частности он отметил такое важное свойство мезенхимальных стволовых клеток как способность придерживаться, распространяться и развиваться на статической поверхности (базальная мембрана органов или пластик in vitro) [8,75].

   Далее клеточная трансплантация претерпевает бурный рост. Для иллюстрации можно привести следующие данные: если в 1990 году в 143 центрах Европы проведено 4234 трансплантации гематогенных стволовых клеток, то в 1994 году - 10066 аналогичных трансплантаций в 306 научных центрах, расположенных в 30 странах. В середине 90-х число трансплантаций гематогенных стволовых клеток в 12 ведущих странах Европы достигло 16-17 операций на 1 млн. человек [5].

Свойства стволовых клеток
1. Отсутствие специализации;
2. Способность к пролиферации с высоким потенциалом деления. Встречаются работы, в которых авторы отмечают наблюдение более 100 циклов деления у стволовой клетки без появления каких-либо дегенеративных изменений и снижения делящегося потенциала [6];
3. Способность к дифференцировке (специализированное направленное деление);
4. Способность к ассиметричному делению (параллельное образование клеток идентичных материнским и имеющих специализированные особенности);
5. Способность к стимуляции регенерации местных тканей в зоне трансплантации;
6. Способность к миграции в наиболее необходимые участки для их местной направленной дифференцировки (хоуминг);
7. Пластичность - способность некоторых стволовых клеток дифференцироваться во многие типы клеток. (Например: гемопоэтические СК могут дифференцироваться в нейроны и другие клетки мозга, миоциты и клетки печени, стромальные клетки костного мозга - в клетки сердечной и скелетной мускулатуры, мезенхимальные клетки могут давать начало остеоцитам, адипоцитам и хондроцитам и.т.д.);
8. Способность придерживаться, распространяться и развиваться на статической поверхности, будь-то базальная мембрана органов или пластик in vitro [8];
9. Способность к регуляции местных и общих факторов иммунологической защиты [23];
10. Стволовые клетки обладают низкой антигенной активностью, связанной не только с отсутствием экспрессированных комплексов гистосовместимости, но и с наличием целого ряда иммуносупрессорных белков [5];
11. Стволовые клетки различных видов, действуя в качестве «одной трансплантируемой группы», могут неоднократно усиливать суммарный клинический эффект после трансплантации. Например, клетки Сертоли, окружающие мужские прогениторные половые клетки, нашли оригинальное применение в экспериментальной неврологии. Их смешивают с нейрональными стволовыми клетками при трансплантации. Выживание нервных стволовых клеток в паре с клетками Сертоли возрастает в несколько раз за счет трофических и барьерных функций герминативной стромы [5].

Источники получения стволовых клеток
1. Костный мозг (КМ) взрослого человека содержит гемопоэтических (1–2%) и стромальных (<0,05%) стволовых/прогениторных клеток [56]. Из одного биоптата выделяют порядка 100000 очищенных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые за счет пассажей удается превратить в 500 млн. незрелых клеток [5]. Кроветворные клетки можно классифицировать на гематопоэтические стволовые клетки (ГСК, hematopoietic stem cells), способные к долговременной постоянной реконструкции всей гемопоэтической системы, и прогениторные клетки, способные к кратковременной (1–2 месяца) реконструкции [57]. ГСК дают начало разным росткам клеток, один из которых (эндотелиальный) способен дифференцироваться в кардиомиоциты. Стромальные стволовые КМ-клетки включают взрослые МСК и мультипотентные взрослые прогениторные клетки (mesenchymal progenitor cells), причем оба типа способны к мультилинеарной дифференциации [57]. В культуре МСК стабильно поддерживают недифференцированный фенотип. Эти клетки можно индуцировать, например, к трансдифференциации в кардиомиоциты посредством 5-азоцитидина, либо ДНК-деметилирующих агентов. Таким образом, мононуклеарная фракция КМ содержит множество клеток, потенциально способных участвовать в восстановлении и регенерации поврежденного миокарда намного эффективнее, чем любые другие изолированные клеточные линии. МСК человека из КМ представляют полезную, легкодоступную и относительно охарактеризованную популяцию для исследований мезенгенеза и очевидно, что эти клетки могут использоваться для аллогенной трансплантации. МСК человека экспрессируют небольшое количество молекул І класса главного комплекса гистосовместимости и почти не экспрессируют молекулы II класса и В7-костимулирующие молекулы, играющих важную роль в инициации антиген-специфического иммунного ответа. In vitro эксперименты с лимфоцитами от разных доноров свидетельствуют о том, что МСК человека не вызывают пролиферации Т-клеток и, на самом деле, могут подавлять смешанную лимфоцитарную реакцию, что, в свою очередь, говорит в пользу клинического использования аллогенных МСК человека [58].

2. Пуповинная кровь (ПК): Многочисленные исследования показали, что ПК является богатым источником гемопоэтических стволовых клеток [69,70,72]. Установлено также, что лимфоидные клетки пуповинной крови менее иммунореактивны, поэтому частичная несовместимость по антигенам HLA-системы при трансплантации гемопоэтических клеток допустима, а частота тяжелой реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) встречается реже, чем при трансплантации клеток костного мозга [72]. При этом приживаемость трансплантата ПК не ниже, чем КМ, даже при использовании меньшего числа вводимых гемопоэтических клеток из расчета на 1 кг массы тела больного. Однако вопрос об оптимальном количестве трансплантируемых клеток пуповинной крови, необходимых для приживления в организме реципиента, до сих пор окончательно не решен. Сбор ПК осуществляется после рождения ребенка и отделения его от последа, когда плацента еще находится in utero или после ее рождения - ex utero, а также при кесаревом сечении (ex utero). Bertolini F. и cоавт. (1995) установили, что, если с момента рождения до отделения новорожденного от плаценты проходит не более 30 сек, то собираемый объем крови, в среднем, на 25-40 мл больше, чем при более позднем отделении ребенка. Ими также отмечено, что раннее отделение ребенка от последа не влечет за собой каких-либо отрицательных последствий для новорожденного [70].

   Следует отметить, что использование ПК для пересадок имеет целый ряд преимуществ перед другими источниками кроветворных клеток:

   Принципиальные различия между стволовыми клетками костного мозга и стволовыми клетками из пуповинной крови заключаются, прежде всего, в количестве получаемых при одном сборе гемопоэтических клеток, используемых в дальнейшем для трансплантации. Если для КМ потери клеточной массы в процессе сепарации, криоконсервирования, размораживания и тестирования допустимы в пределах 40-50%, то для ПК такие потери клеток не допустимы, так как при пересадке может возникать несостоятельность трансплантата. Так, по данным Kogler и др. (1998 г.) для трансплантаций при массе тела реципиента 10 кг (из общей численности 2098 собранных образцов ПК) потенциальными трансплантатами могут быть все образцы ПК, при массе 35 кг - 67%, и лишь 25% образцов смогут обеспечить больных с массой 50-70 кг [71].

3. Цельная кровь. Количество содержащихся в цельной крови стволовых клеток меньшее, чем, например, в пуповинной крови или в костном мозге, и культивирование их является процессом трудоемким и часто нерентабельным. Незрелые стромальные (СD-34-) клетки выявлены в циркулирующей крови. Таких клеток в костном мозге многим меньше, чем CD34+ предшественников (одна клетка на миллион клеток костного мозга) [76,77]. В культуре эти клетки прикрепляются к подложке, формируя островки фибробластоподобных клеток. В незрелом состоянии клетки пролиферируют в течение нескольких пассажей, сохраняя плюрипотентность (способность дифференцировки в линии адипоцитов, миофибробластов, стромы гематогенной ткани, клетки хряща и кости). Ограниченная популяция СD-34 -негативных стромальных клеток из кровотока возвращается в строму костномозговой ткани, где трансформируется в линии CD-34+ гематогенных стволовых клеток. Эти наблюдения позволили заключить, что рециркуляция прогениторных мезенхимальных клеток в кровотоке позволяет поддерживать баланс стволовых клеток в разных органах через общий пул клеток [76,77].

4. Эмбриональные и фетальные ткани: Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК; embryonic stem cells) выделяют из эмбрионов ранних стадий развития. На стадии бластоцисты зародыш состоит из 70 трофобластных клеток и около 30 клеток внутренней клеточной массы бластулы — эмбриобласта. Именно последние являются плюрипотентными СК, дающими начало всем клеточным типам основных зародышевых листков эмбриона — эктодерме, мезодерме и эндодерме. Сейчас стало возможным выделить эти СК из бластоцисты новым методом иммунохирургии — путем лизиса трофобластных клеток определенными молекулами иммунной системы, а клетки эмбриобласта поддерживать в недифференцированном состоянии в культуре в виде клеточных линий. Также выделены эмбриональные половые клетки (primordial germ cells, embryonic germ cells) из развивающегося полового бугорка [54].

Анатомо-физиологическая и биохимическая ниша стволовых клеток
   С момента открытия и идентификации стволовых клеток вопрос о наличии факторов, позволяющих этим клеткам направленно и одновременно асинхронно дифференцироваться в те или иные формы, по сей день, окончательно не закрыт. Гипотеза существования анатомо-физиологических и биохимических ниш стволовых клеток, предложенная Schofield почти 30 лет назад (1978 г), с общепринятой точки зрения является на сегодняшний день наиболее удобной, объясняющей наиболее полно клеточные взаимоотношения, приводящие к дифференцировке [9]. Их природа наиболее полно исследована при изучении гемопоэза [10] и подтверждена работами в других областях [11,12]. Отмечено, что строма и стромальные ячейки вместе обеспечивают физическую поддержку предшественникам созревания специализированных клеток и служат архивом широкого диапазона полученных ячейкой копий и сигналов, ведущих к возникновению новых клеток, способствуют их дальнейшей дифференцировке и созреванию [12].

   Анатомо-физиологическая и биохимическая ниша стволовых клеток – это особенные условия и взаимоотношения клеточной микросреды (клеточные, биохимические и молекулярные), обеспечивающие существование и течение биологических процессов, необходимых для существования и функции стволовых клеток. Ниша сохраняет СК от истощения, регулируя их дифференцировку, и является основным модулем физиологии ткани, объединяя сигналы, которые добиваются сбалансированного клеточного ответа к потребностям органа-мишени. Изменения условий ниши ведет к нарушениям процессов дифференцировки, так как стволовые клетки и ниши составляют динамическую систему, определяющую регенерационные способности тканей организма. В цитобиологии ниша рассматривается по биологическим линиям. Простое выявление СК недостаточно для того, чтобы определить нишу. Ниша имеет анатомические и функциональные измерения, и создает условия для жизнедеятельности СК. Условия ниши определяют функцию стволовых клеток [22].

   Ниша уникальна для каждого вида стволовых клеток, но, тем не менее, для направленного деления в различные типы клеток, может быть использована одна и та же ниша. Например, в костном мозге физиологическое соседство мезенхимальных и гематопоэтических клеток часто приводит к тому, что для направленной дифференцировки разных типов клеток используются одни и те же ниши. В данном случае, направление дифференцировки определяют внеклеточные и межклеточные сигналы, являющиеся различными для разных типов клеток [9]. Отмечено, что стволовые клетки определяются в различных органах и тканях и функционируют везде, где в естественных условиях или in vitro для них формируются ниши [9,11,12,22]. Выявление стволовых клеток, существующих вне ниш, позволило появиться концепции о существовании внеклеточной матрицы. В качестве примера можно указать, что у млекопитающих существуют источники СК в коже, представляющих собой процесс ограниченной локализации примитивных СК путем взаимодействия 3-1 интегринов с матричным гликопротеином ligands.

   СК и внеклеточно-матричные компоненты ниши предсказуемы, хотя процессы их взаимодействия не совсем понятны. В семенниках мухи дрозофилы компонент UPD вызывает дифференцировку ССК через киназу Джанаса (JAK) – преобразователь сигналов и активатор транскрипции (STAT) [22].

Потенциал дифференцировки
   Абсолютный потенциал самообновления стволовых клеток на сегодняшний день является открытым вопросом. Какой-либо линейной зависимости активности дифференцировки стволовых клеток не существует. Потенциал дифференцировки является процессом, зависящим от воздействия внешних факторов, что подтверждается в опытах in vitro, когда введение активаторов роста (например, фактор роста фибробластов - FGF-2) к основной среде приводит к удвоению митотической активности стволовых клеток [13]. Сомнительно, что митотическая активность и дифференцировка зависит от воздействия какого-либо одного стимулирующего или тормозящего фактора. Сложность дифференцировки, в частности, ассиметричная дифференцировка, подразумевает воздействие нескольких факторов, что подтверждается в работе Bianco et al. (2001) [14].

   У различных биологических видов, будь-то человек, кролик или крыса, одни и те же виды стволовых клеток в пробирке или в естественных условиях дифференцируются только в определенные типы клеток, в зависимости от факторов микроокружения. Следовательно, стволовые клетки обладают гетерогенным потенциалом дифференцировки. Одна клетка в результате разных митозов способна дать потомство как непохожее на саму себя, так и различающееся видами дочерних клеток. Ее потомки могут принадлежать разным видам. Возникает закономерный вопрос: все ли стволовые клетки обладают подобным эффектом? Pittinger et al. (1999) сообщил, что в исследуемой им популяции мезенхимальных стволовых клеток только около 30% являлись плюрипотентными, основная же масса могла образовать только один или два вида клеток разных видов [15]. Кузнецов C.А. и соавт. (1997) отметили, что только 58,8 % имеющихся стволовых клеток были способны к митотической активности при регенерации костного материала у иммунодефицитных животных [16]. Соответственно, чем мощнее клетка, чем большую активность к мультивидовой дифференцировке она может проявить, тем реже она встречается. Кроме того, можно предположить, что эти клетки обладают низкой дифференцирующей активностью по времени, а суммарный срок их активной митотической жизнедеятельности небольшой. Основную нагрузку несут мульти- и унипотентные клетки. Добавление же фактора роста фибробластов (FGF-2) ведет к активации всех подгрупп мезенхимальных стволовых клеток, но наиболее активно для тех, которые обладают более высоким ростовым потенциалом [17].

Регуляция дифференцировки биохимическим путем и методами генной инженерии
   Примеры монофакторно управляемой дифференцировки ЭСК весьма немногочисленны: в узком диапазоне концентраций ретиноевая кислота индуцирует нейрогенез, ВМР-2 - образование эпителия энтодермы, TGF-beta - преимущественно в мышечные линии, IL-6 - эритроидные линии, IL-3 - моноцитарно-миелоидные линии [5].

   Для объяснения процессов направленной дифференцировки интересна модель, предлагаемая группой авторов D. Baksh et al. (2004), которая разделена на 2 этапа [9]. На первом этапе стволовые клетки подвергаются транскрипционной модификации, производя аналогичные клетки без очевидных фенотипических изменений и способности к дифференцировке. Подобные клетки постоянно находятся в костном мозге взрослой особи любого вида в неподвижном состоянии без признаков дифференцирования и активируются только при добавлении факторов роста. При добавлении FGF-2 (2 этап) наблюдается ассиметричное деление этих клеток. Одна дублирует материнскую, вторая же становится клеткой предшественником с более ограниченными возможностями к дифференцировке. Клетка предшественник продолжает делиться, образуя мультипотентные клетки, которые морфологически напоминают мультимощные мезенхимальные клетки, но отличаются от них по репертуару транскрипции гена и поэтому продолжают занимать оставленную для них нишу. Полученные клетки делятся симметрично, производя унипотентные клетки, которые приобретают специфические свойства на пути к формированию клеток с различными фенотипами.

   Механизм регуляции, состоящий из межклеточных взаимодействий и ростовых факторов, в настоящее время полностью не изучен. Установлено, что в процессах регуляции играют роль факторы транскрипции, цитокины, факторы роста и внеклеточные матричные молекулы [9]. В настоящее время идентифицированы локусы генов, которые определяют дифференцировку и регулируют остеогенез, адипогенез и хондрогенез [18], но эти же исследователи не смогли выявить локусы, ответственные за дифференцировку более чем по одному направлению, т.е. главные гены управления. В работе, которая посвящена 39000 расшифровок человеческого генома U133, сообщается, что участки состоящие из 914, 947 и 52 генов определяют дифференцировку унипотентных мезенхимальных стволовых клеток, а локусы, состоящие из 235, 3 и 10 генов отвечают за дифференцировку клеток по двум направлениям (например, остео- и хондроциты). Наиболее интересна группа, состоящая из 8 генов, стимулирующая роль которых проявилась в дифференцировке мезенхимальных клеток по 3 направлениям, поэтому она более или менее напоминает «главные гены управления». К ним относятся: Period gomolog 1 (PER 1), nebulette (NEBL), молекула прилипания ячейки нейронала (NRCAM), FK506 – связывающий протеин 5 (FKBP5), интерлейкин 1 для 2 типа рецепторов (IL1R2), zinc finger protein 145 (ZNF145), ингибитор металлопротиназы 4 (TIMP4), и serum amyloid A2. Функция этих генов охватывает широкую область клеточных процессов, таких как фиксация клетки, глобуляция белка, формирование актинового цитоскелета и формирование стимулирующего потенциала деления [9]. Таким образом, стимуляция клеточной дифференцировки является сложным процессом, требующим взаимодействия множества факторов. Например, для того, чтобы получить in vitro остеоцит, необходимо наличие мультипотентной стволовой клетки, которая в результате ассиметричного деления образует клетку остеопредшественник, который в свою очередь путем симметричного деления образует остеопрогенитор, затем проостеобласт, функциональный остеобласт, и, в конечном итоге, остеоцит. Эта цепочка невозможна без своевременной активации и депрессии факторов транскрипции, а именно Cbal/Runx2, Msx2, Dlx5, Osx и активации связанных с костью генов маркера, т.е остеопоэтина, щелочной фосфатазы, сиаловых остеопротеинов и остеокальцина. Кроме того, отмечена роль Wnt- гликопротеинов, богатых цистеином, которые активно участвуют в остеогенезе во время эмбрионального развития и оказывают стимулирующую роль [9,19]. Нарушение этой цепочки ведет к формированию элементов незавершенного остеогенеза.

   Логично, что следующим шагом в применении клеточной терапии было создание стволовых клеток с генетически запрограммированной ДНК для направленной дифференцировки. Встречаются работы [20], в которых авторы, используя вирусную трансдукцию, добивались появления клеток, обладающих высокой эффективностью дифференцировки и низкой смертностью. Традиционные методы трансфекции, такие как преципитация фосфата кальция, липофекция и электропорация, не могут считаться эффективными при установке плазмиды в ДНК мезенхимальной стволовой клетки, так как эффект не превышает 1 % [20]. Для подобных работ в настоящее время используются такие методы, как нуклеофекция (Amaxa Biosystems), трансфекция на основе вибрации (Synphonizer, Mollennium Inc., Japan) и метод nonvirally transfecting cells. По некоторым данным их эффективность достигает 80% по сравнению с традиционными методами [20].

   Интересна работа Simonsen J.L. (2002), где сообщается, что при добавлении к культуральной среде человеческого фермента транскриптазы, заменяющего теломеразу (hTER), увеличивается число митозов более чем на 260 для каждой клетки [21]. Tenascin C. усиливает чувствительность СК к фактору роста фибробластов (FGF-2), увеличивая их способность к глиальной дифференцировке [22].

   Таким образом, на сегодняшний день имеются реальные возможности для направленной дифференцировки стволовых клеток биохимическим путем и методами генной инженерии.

Иммунологические аспекты трансплантации МСК
   Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга стимулируют дифференцировку разных популяций Т-лимфоцитов (СD4+, СD8+,Е клеток памяти), специфически взаимодействуя как с собственными иммунокомпетентными клетками, так и с клетками реципиента при аллогенных трансплантациях, что обуславливает активное применение клеточных технологий в клинической практике [24]. Мезенхимальные стволовые клетки не лизируются в смешанных культурах аллогенными ядросодержащими клетками периферической крови или Т-лимфоцитами и NK-клетками, значительно ингибируют пролиферацию Т-лимфоцитов в ответ на активацию поликлональными стимуляторами (например, фитогемагглютинином, анти-CD3 антителами или профессиональными антиген-презентирующими клетками (АПК). Эффект как правило обратим [25]. Встречаются работы, в которых сообщается о зависимости ингибирования пролиферации Т-лимфоцитов от количества взаимодействующих с ними МСК. Эффект ингибирования возникает при наличии соотношения МСК/лимфоциты равное 1:10 или 1:100, причем этот эффект является универсальным явлением независимо от биологического вида. Супрессивный лимфоцитарный эффект МСК может быть усилен добавлением гамма-интерферона [25], в то время как введение интерлейкина-2 частично ослабляет ингибирование пролиферации [26]. Вопрос о степени влияния и длительности его в настоящее время, ввиду противоречивых данных, остается дискутабельным.

   МСК, дифференцирующиеся в течение 1-2 недель в остеогенном, хондрогенном и адипоцитогенном направлениях, не повергаясь лизису в смешанных культурах, сохраняют иммуносупрессивные свойства [23,25]. Встречаются работы, в которых подтверждается сохранение клеток в течение 13 месяцев в органах хозяина при отсутствии иммуносупрессии [16]. МСК оказывают благоприятный эффект на приживление несовместимого органа при их совместной трансплантации. Предварительное введение МСК способно увеличивать выживаемость аллогенного кожного трансплантата у обезьян [26]. Этот эффект наблюдался только при условии изогенного происхождения МСК и кожного трансплантата. Интересен факт опухолевого роста клеток меланомы при их совместном подкожном введении с ССК/МСК в организм мыши, тогда как без МСК клетки меланомы быстро отторгались [27].

Возможные механизмы иммунологических эффектов, опосредованных МСК
1. Активация Т-клеточного рецептора лимфоцитов реципиента (TCR-CD3) без сопутствующей СD28-костимуляциии;
2.Взаимодействие неизвестных поверхностных молекул;
3.Секреция ССК/МСК простагландина E2;
4. Индукция экспрессии в ССК/МСК фермента indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), который катализирует конверсию триптофана в kynurenine;
5. Секреция ССК/МСК трансформирующего фактора роста бета (TGF betta) и фактора роста гепатоцитов (HGF);
6. Секреция ССК/МСК неизвестного растворимого посредника, с выраженной иммуносупрессивной активностью [23].

   Вопрос о превалирующей роли клеточно-клеточных контактов, обуславливающей наличие иммунологических характеристик стволовых клеток в настоящее время остается дискутабельным. МСК ингибируют дифференцировку моноцитов разными способами в зависимости от соотношения культивируемых клеток [28]. При высоких соотношениях (1:10) основную роль играют растворимые факторы, тогда как при низких разведениях (1:40) необходимо наличие клеточно-клеточных контактов. Реализация иммунологических свойств МСК, по-видимому, обусловлена опосредованным клеточно-клеточным взаимодействием и секрецией растворимых факторов [23].

   МСК человека характеризуются отсутствием экспрессии костимулирующих молекул B7-1, B7-2 и CD40 [26]. Контакт Т-клеточного рецептора и главного комплекса гистосовместимости при отсутствии костимулирующего сигнала приводит к состоянию анергии Т-лимфоцитов [31]. Так как взаимодействие является антигенспецифичным, анергии подвергаются только определенная субпопуляция Т-лимфоцитов, и таким образом достигается толерантность ко всем клеткам одного происхождения. Этот механизм не может участвовать в супрессии пролиферации Т-клеток в реакции смешанной культуры лимфоцитов, но вполне объясняет длительную выживаемость кожного аллотрансплантата у приматов [26].

   В настоящий момент получены противоречивые данные при идентификации конкретного растворимого посредника иммуносупрессивных эффектов МСК. Обнаружено, что простагландин Е2 (PGE2), секретируемый ССК/МСК, был частично ответственен за опосредованные МСК иммуномодулирующие эффекты, так как они блокировались двумя разными PGE2 ингибиторами [23,30]. При использовании нейтрализующих моноклональных антител показана иммуносупрессивная роль фактора роста гепатоцитов [29]. Эти работы предоставляют почву для дальнейших исследований, так как большинство аналогичных посредников иммуносупрессии в настоящее время не открыто.

Применение трансплантации МСК в клинической практике
   Учитывая возможности высокого регенераторного потенциала стволовых клеток и их множественные трансплантационные эффекты, в настоящее время они используются в различных областях клинической медицины. Например, трансплантация костного мозга, ранее приравнивающаяся к пересадке органа и выполняющаяся только в крупных трансплантационных центрах, видоизменилась в последние годы до трансплантации гемопоэтических клеток и стала самым широко применяемым методом клеточной трансплантации в клинической практике.

   В одной из работ (Берсенев А.В., 2005) нам встретилась удобная с нашей точки зрения классификация использования клеточных технологий в клинической практике [34].

   Широкое клиническое применение (методы, прошедшие клинические испытания и доказавшие свою эффективность, выполняемые во многих медицинских центрах):
- аллогенная трансплантация гемопоэтических клеток (костного мозга, пуповинной и мобилизованной периферической крови) в гематологии, включая онкогематологию [34,35];
- трансплантация (аллогенная и ксеногенная) островковых клеток поджелудочной железы при сахарном диабете [36];
- аутогенная трансплантация хондроцитов при посттравматических повреждениях хряща коленного сустава [35];
- трансплантация аутологичных и аллогенных фибробластов для лечения косметических дефектов кожи и трофических язв [37].

   Ограниченное клинические применение (методы, показавшие свою клиническую эффективность в ряде исследований, но широкое применение которых ограничено в связи с остановкой испытаний, сложностью выполнения, законодательством и этическими соображениями в различных странах):
- аллогенная трансплантация гепатоцитов при врожденных метаболических дефектах у детей и печеночной недостаточности, при тяжелой энцефалопатии и при ожидании донорского органа [38];
- трансплантация аллогенных нейрональных клеток при лечении болезни Паркинсона [39].

   Клинические испытания (I-III фаза) (методы успешной трансплантации, находящиеся на различных стадиях клинических испытаний или к началу набора пациентов одобренные Управлением по продуктам и лекарствам (FDA) или другими организациями, более чем в двух центрах в различных странах мира):
- аутогенная трансплантация гемопоэтических клеток мобилизованной крови при заболеваниях с преимущественно аутоиммунным патогенезом (рассеянный склероз, системная красная волчанка, болезнь Крона, резистентный ювенильный ревматоидный артрит) [40];
- трансплантация гемопоэтических клеток в комплексном лечении солидных опухолей (рак почки, молочной железы, поджелудочной железы, головного мозга) [41];
- трансплантация аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для профилактики болезни «трансплантат против хозяина» после предшествующей трансплантации гемопоэтических клеток [23,42];
- адаптивная иммунотерапия (цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки) в онкологии, клеточные онковакцины (на основе дендритных клеток) [43];
- клеточная кардиомиопластика (миобласты скелетной мышечной ткани, ядросодержащие клетки костного мозга, CD34+ и CD133+ клетки костного мозга и мобилизованной периферической крови, аллогенные мезенхимальные клетки костного мозга) [44];
- трансплантация аутологичных гемопоэтических клеток при первичном амилоидозе [45];
- местная аутогенная трансплантация клеток костного мозга при асептическом некрозе головки бедренной кости [46];
- трансплантация нейрональных клеток (из линии тератокарциномы) пациентам с постинсультным состоянием [47];
- трансплантация аутологичных мезенхимальных (стромальных) клеток костного мозга при дефекте хряща коленного сустава [5,48];
- трансплантация аллогенных нейрональных клеток при болезни Хантингтона [49];
- трансплантация аллогенных и эутологичных клеток костного мозга (мононуклеарных и мезенхимальных) для оптимизации регенерации костной ткани после переломов [50];
- трансплантация нейральных стволовых клеток в мозг крыс подвергавшихся острой гипоксии и при травме спинного мозга [53,78];
- трансплантация нейральных стволовых клеток при нейросенсорной тугоухости [53], при эпилепсии [61];
- при лечении инсулинзависимого сахарного диабета [62,82] и при диабетической стопе [64];
- трансплантация мононуклеаров костного мозга при ишемической болезни нижних конечностей [63], при болезни Бюргера [65];
- трансплантация фетальных клеток печени человека для лечения ишемической болезни сердца и ген-модифицированных гепатоцитов для лечения семейной гиперхолестеролемии [66,80].
- трансплантация при длительно незаживающих раневых поверхностях, трофических и лучевых язвах, ожогах [67,78];
- трансплантация стволовых клеток при хронической почечной недостаточности [68];
- при хроническом пародонтите [74];
- трансплантация нормальных миобластов в мышцы пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна [5];
- трансплантация человеческого фетального или трупного ретинального пигментного эпителия в субмакулярное пространство пациентов с старческой макулярной дегенерацией [5];
- трансплантация фетальной спинальной ткани в хроническую кисту для уменьшения размера сирингомиелии [5];
- трансплантация кроветворных фетальных клеток в лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [81].

   Интересно применение трансплантации культур стволовых клеток для лечения иммунной реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ). В Швеции, 9-ти летнему мальчику, страдающему острой формой лимфобластного лейкоза и перенесшему аллотрансплантацию гемопоэтических клеток, была выполнена инфузия аллогенных ССК/МСК от матери, с целью лечения РТПХ IV степени тяжести. При исследовании иммуносупрессивной активности ССК/МСК матери в культуре оказалось, что эти клетки на 90% ингибируют пролиферативную активность лимфоцитов первого аллогенного трансплантата. Благодаря такой трансплантации гемопоэз мальчика восстановился. При сохранении остаточных гематологических признаках РТПХ он имеет хорошие показатели качества жизни [25].

   Перспективным направлением в лечении заболеваний с преимущественно аутоиммунным патогенезом, являются работы по трансплантации костного мозга в моделях артрита и системной красной волчанки, результаты которых обсуждаются в обзоре Jorgensen [52].

   Как известно, от первых экспериментальных исследований до окончания клинических испытаний нового метода проходит 5-10 лет. Поэтому о клинической эффективности многих методов клеточной говорить ещё рано. В настоящее время продолжаются испытания по оптимизации протоколов тех методов, которые уже активно применяются в клинике. Кроме того, продолжают появляться новые работы о доклинических испытаниях методов клеточной трансплантации на различных моделях болезней человека. Огромный интерес биологов и врачей к трансплантации клеток указывает на перспективность и большие надежды, возлагаемые на эти методы.

Осложнения клеточной трансплантации
   Наиболее значительными рисками использования ЭСК в практической медицине являются два: образование опухолей и иммунное отторжение. Как известно, ЭСК человека, имплантированные мышам, могут дать начало опухолям мягких тканей. Предположительно, такой ответ связан с плюрипотентностью недифференцированных клеток in vivo. Хотя есть ряд работ, где не обнаружено статистически достоверного опухолеобразования [55]. На потенциальный риск канцерогенеза из взрослых стволовых клеток человека после их трансплантации указывают те факты, что они экспрессируют общие маркёры с эмбриональными стволовыми клетками и многими злокачественными линиями [83]. Кроме того, из многих злокачественных новообразований человека были выделены и охарактеризованы так называемые инициирующие опухоль клетки, которые, как оказалось, имеют общие характеристики (маркёры) с нормальными взрослыми стволовыми клетками [84]. Как выяснилось, по поводу онкогенной активности трансплантируемых клеток, полученные данные не являются однозначными. Daniel Rubio (2005) описал популяцию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) человека, выделенную из подкожной жировой клетчатки, демонстрирующую злокачественные характеристики [85]. В культуре CD13+/CD90+/ CD105+/CD106+ ММСК после 2-х месячного пассирования (более 20 делений) стали появляться трансформированные клетки, характеризующиеся высокой способностью к канцерогенезу в 100% у мышей-реципиентов [86]. CD133+ клетки вызывали канцерогенез (преимущественно в лёгких, печени и канцероматоз брюшины) у облучённых мышей через 4-6 недель после интраперитонеальной и внутривенной трансплантации 2,5-10 миллионов клеток в 10 из 13 и в 3 из 12 случаев соответственно, и у 100% животных - через 8 недель [87]. Общая биологическая способность ММСК к онкогенетической трансформации остаётся дискутабельной. Так, было показано, что ММСК костного мозга человека легко иммортализуются и после 256 удвоений дают рост опухолей in vivo в 100% случаев [88]. С другой стороны, группа Kassem (2002) указывает, что при длительном пассировании ММСК, выделенных из костного мозга человека они не получили никаких признаков иммортализации после 40 удвоений [86]. Интересно, что ММСК мыши также подвержены спонтанной трансформации в культуре и демонстрируют сходную с человеческими злокачественность in vivo [85].

   Эти осложнения встречаются гораздо реже и статистически сравнимы с подобными осложнениями при других методах лечения.

   Таким образом, трансплантация стволовых клеток на сегодняшний день является перспективным методом, использующимся в различных областях современной медицины. Несмотря на определенные сложности по его применению и многие юридические нюансы по его законодательному обеспечению, метод обещает в будущем блестящие перспективы, которые будут использованы для лечения и профилактики многих заболеваний.

Литература
1) Лищук В.А., Мосткова Е.В., «Стволовые клетки: исследования и практика». Валеология, №2, 2003.
2) Курило Л.Ф. Некоторые этические вопросы технологии эмбриональных стволовых клеток, Проблемы репродукции, №3, 2000.
3) Временная инструкция о порядке исследований в области клеточных технологий и их использования в учреждениях здравоохранения. Экспертный Совет Минздрава России (18.04.2002).
4) Филатов В.Ф., Загорцева Л.Л., Яковцева А.Ф., Желудева В.И., Журнал болезней уха, горла и носа, №5, 1978, с.72.
5) Репин В.С., Сухих Г.Т., Медицинская клеточная биология, 1998 г.
6) Verfaille C. medical Promise of Adult Stem Cell Research (Present and Projected) // The Presidents Councill of Bioethics 3d meeting. 2002.
7) Ярыгин В.Н., Клеточные технологии – медицине. Докл. на Президиуме РАМН,29.05.2002.
8) Friedenstein A.J., Osteogenetic activity of transplanted
transitional epithe lium, Acta Anat. (Basel), 45: 31-59, 1961.
9) D. Baksh, L. Song, R. S. Tuan, Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy, J. Cell. Mol. Med. Vol 8, No 3, 2004 pp. 301-316.
10) Janowska-Wieczorek A., Majka M., Ratajczak J., Ratajczak M.Z., Autocrine/paracrine mechanisms in human hematopoiesis, Stem Cells, 19: 99-107, 2001.
11) Calvi L.M., Adams G.B., Weibrecht K.W., Weber J.M.,Olson D.P., Knight M.C., Martin R.P., Schipani E., Divieti P., Bringhurst F.R., Milner L.A., Kronenberg H.M., Scadden D.T., Osteoblastic cells regulate thehaematopoietic stem cell niche, Nature, 425: 841-846, 2003.
12) Koller M.R., Manchel I., Palsson B.O., Importance of parenchymal:stromal cell ratio for the ex vivo reconstitution of human hematopoiesis, Stem Cells, 15: 305-313,1997.
13) Castro-Malaspina H., Gay R.E., Resnick G., Kapoor N., Meyers P., Chiarieri D., McKenzie S., Broxmeyer H.E., Moore M.A., Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny, Blood, 56: 289-301, 1980.
14) Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G., Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications, Stem Cells, 19: 180-192, 2001.
15) Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science, 284: 143-147, 1999.
16) Kuznetsov S.A., Krebsbach P.H., Satomura K., Kerr J., Riminucci M., Benayahu D., Robey P.G., Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo, J. Bone Miner. Res., 12:1335-1347, 1997.
17) Bianchi G., Banfi A., Mastrogiacomo M., Notaro R., Luzzatto L., Cancedda R., Quarto R., Ex vivo enrich ment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2, Exp. Cell Res., 287: 98-105, 2003.
18) Doi M., Nagano A., Nakamura Y., Molecular cloning and characterization of a novel gene, EMILIN-5, and its possible involvement in skeletal development, Biochem.Biophys. Res. Commun., 313: 888-893, 2004.
19) Harada S., Rodan G.A., Control of osteoblast function and regulation of bone mass, Nature, 423: 349-355, 2003.
20) Song L., Chau L., Sakamoto Y., Nakashima J., Koide M., Tua n R.S., Electric field-induced molecular vibration for noninvasive, high-efficiency DNA transfection, Mol. Ther., 9: 607-616, 2004.
21) Simonsen J.L., Rosada C., Serakinci N., Justesen J., Stenderup K., Rattan S.I., Jensen T.G., Kassem M., Telomerase expression extends the proliferative life-span and maintains the osteogenic potential of human bone marrow stromal cells, Nat. Biotechnol., 20: 592-596, 2002.
22) Scadden D.T., The stem-cell niche as an entity of action. Nature. Vol. 441, 29 june 2006.
23) Сергеев В.С., Иммунологические свойства стромальных (мезенхимальных) стволовых клеток. Клеточные технологии, 04,2005.
24) Dejbakhsh-Jones S, et al. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J Immunol 1995; 155: 3338-3344.
25) Le Blanc K, et al. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol 2003; 31: 890-896.
26) Bartholomew A, et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol 2002; 30: 42-48.
27) Djouad F, et al. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals. Blood 2003; 102: 3837-3844.
28) Jiang X, et al. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells. Blood (prepublished online Feb 3, 2005); DOI 10.1182/blood-2004-02-0586.
29) Di Nicola M, et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood 2002; 99: 3838-3843.
30) Aggarwal S. and Pittenger M. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood 2005; 105: 1815-1822.
31) Schwartz RH. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science 1990; 248: 1349-1356.
32) Niehans P, Die Zellulartherapie. Verlag von Urban & Schwarzenberg. Мunhen- Berlin, 1954.
33) Маслюков А.К., Сугачевскэя Т. В. Стволовые клетки и их применение в практической медицине. http: / / www.transplantologу.соm/ content/ vie w/ 363/78/.
34) Берсенев А.В. Клеточная трансплантология: история, современное состояние и клеточные перспективы. Обзор литературы. Клеточная трансплантология и тканевая инжененрия. №1, 2005, стр. 49-56.
35) Clinical Bone Marrow and Blood Stem Cell Transplantation. By ed. Kerry Atkinson. "Cambridge University Press" 2003; 3rd ed., 2OOO pp.
36) Kobayashi N.. О kits u Т.. La key J.R., Tanaka N. The current situation in human pancreatic islet transplantation: problems and prospects. JArcif Organs. 2004; 7: 1.
37) Watson 0. Keller G.S., Lacombe V. et al, Autologous fibroblasts for treatment of facial rhytids and dermal depressions. Arch Facial Plast. Surg 1090: 1: 165.
38) Brittberg M., Tallheden Т.. Sjogren-Jansson a. et al. Autologous chondrocytes used for articular cartilage repair: an update. Clin Orthop Retat Res 2001; ЭЭ1: 337.
39) Lindvatl 0., Bjorklund A. Cell Therapy in Parkinson's Disease. Neuron* 2004; 1:3B2.
40) Берсенев А.В., Станков Д.С. Аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при рассеянном склерозе - итоги 7-летних исследований, http://cetltranspl.ru/journal/ puolications/ MESSAGES[1]-SHOW_PUBLICAT1QN PUBLICATI0N JD-429.
41) Umbilical cord blood for stem cell transplantation in treating young patients with malignant or nonmalignant diseases. http://www.cli nicaltrials.gov/ct/show/N CT000846 S5?order=3.
42) Lazarus H.M., Кос O.N., Devine S.M. et al. Cotransplantetion of HLA-identical sibling culture-expanded mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients. Biot Blood Marrow Transplant 2005: 11 (5): 389.
43) Cellular adoptive immunotherapy in treating patients with stage III or stage IV ovarian cancer.http://www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00101257?order=9.
44) Lee M.S.. LJII M., Makkar R.R. Stem cell transplantation in myocardial infarction. Rev Cardiovasc Med 2004; S: 82.
45) Tandam autologous stem cell transplantation in treating patients withprimary systemic (AL] arrtylaidosis.http://www.dinicaltriBls.gov/ct/shaw/NCTOOO75621 order-3.
46) Gangji V., Hauzeur J.P. Treatment of osteonecrosis of the femoral head with implantation of autologous bone-marrow celts. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am 2005; 87 Suppl 1[Pt 1): 10Б.
47) Kondziolka D., Wechsler L. Goldstein S. et al. Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke. Neurology 2000; 55: 565.
48) Wakitani S., Imoto K., Yamamoto T. et al. Human autoiogous culture expanded bone marrow mesenchymal cell transplantation for repair of cartilage defects in osteoarthritic knees. Osteoarthritis Cartilage 2002: 10: 199.
49) Safety and feasibility of neural transplantation in early to moderate Huntington's disease in the UK. http://controlled-tnafs.co.
50) Bane regeneration using stromal cells. http://www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCTOOOO1391 ?order=258.
51) Arinzeh TL, et al. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect. J Bone Joint Surg Am 2003; 85-A; 10: 1927-1935.
52) Jorgensen C, et al. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy. Gene Therapy 2003; 10: 928–931.
53) Александрова М.А., Ревищин А.В., Подгорный О.В., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т., Трансплантация культивированных нейральных стволовых клеток плода человека в мозг крыс, подвергавшихся острой гипоксии. БЭБиМ., 2004, том 134, №3, с. 296-300.
54) Д.А. Зубов. Стволовая клетка: от определения к возможностям клинического применения.
55) Odorico J.S., Kaufman D.S., and Thomson J.A. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines // Stem Cells. - 2001. - Vol. 19. - P. 193-204.
56) Strauer B.E. and Kornowski R. Stem cell therapy in perspective // Circulation. - 2003. - Vol. 107. - P. 929-934.
57) Orlic D., Hill J.M., Arai A.E. Stem cells for myocardial regeneration // Circ. Res. - 2002. - Vol. 91. - P. 1092-1102.
58) Marshak D.R., Gardner R.L. and Gottlieb D. Stem Cell Biology. - Gold Spring Harbor: Laboratory Press, 2002. - 544 p.
59) Мітін Ю.В., В.I. Цимбалюк, В.Л.Дідковський ; Актуальні питання використання ембріональної нервової тканини при нейросенсорній приглухуватості., официальный сайт НИИ криобиологии и криотехнологий Украины.
60) Миронов И. Н., B. C. Бугаев, Н. В. Миронов, Г. Т. Сухих; Терапия рассеянного склероза (новые аспекты), Клеточные технологии.
61) Акимова И. М., Ф. А. Гурчин, Н. Ю. Королева, Л. А. Мелючева, Е. А. Тайц Клиническое применение трансплантации эмбриональных зачатков мозга при заболевании эпилепсией., тезис, Институт мозга человека РАН, Санкт-Петербург.
62) ГРИЩЕНКО В.И., БОБЫРЕВА Л.Е., БУГАЕВ В.Н., ШЕПИТЬКО В.И., ДВОРНИК И.Л., КАТЕРЕНЧУК В.И., БОБЫРЕВ В.Н. БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭМБРИОНАЛЬНО-ТКАНЕВОЙ ТЕРАПИИ ИНСУЛИНОЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА, тезисы.
63) Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial. Lancet 2002; 360: 427–435.
64) Kudo FA, et al. Autologous transplantation of peripheral blood endothelial progenitor cells (CD34+) for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Int Angiol 2003; 22; 344-348.
65) Teiji O. Treatment for limb ulcer with severe ischemia: therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow. Wound Repair Regen. 2004; 12; 1: A5 (abstract).
66) Клеточная терапия дислипидемий и атеросклероза (аналитический обзор)
А.В. Берсенев., Крашенниников М.Е., Онищенко Н.А. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2001; 2: 46-53.
67) Селедцов В.И, О.В. Повещенко, В.В. Сенюков, В.Я. Тарабан, В.А. Козлов, информация Официального сайта Института клинической иммунологии СО РАМН (директор - член-корр. В.А Козлов) Biolib.by.ru.
68) Ohashi К., Yoshiyuki Nakajima, Mark A Kay LIVER TISSUES ENGINEERED AT THE KIDNEY CAPSULE AND THEIR REGENERATION POTENTIAL. Program in Human Gene Therapy, Departments of Pediatrics and Genetics, Stanford University Medical Center, Stanford, USA, First Department of Surgery, Nara Medical University, Nara, Japan .
69) Almici C., Carbo-Stella C., Mangoni L. et al. Biologic and phenotypic analisis of early hematopoietic progenitor cells in umbilical cord blood// Blood.- 1997.- Vol.90, N.10.- P.339b (4274).
70) Bertolini F., Battaglia M. et al. Placental blood collection: Effects on Newborns// Blood.- 1995.- Vol.85.- P.3361-3362.
71) Kogler G., Sarnowski A., Wernet P. Volume reduction of cord blood by Hetastarch for long-term cell banking// Bone Marrow Transplant.- 1998.- Vol. 22.- Suppl. 1.- P. S.14-15.
72) Arcese W., Aversa F., Bandini G. et al. Clinical use of allogeneic hematopoietic stem cells from sources other than bone marrow// Haematologica.- 1998.- Vol. 83.- N. 2.- P. 159-182.
73) Ullman J., Perry E., Fausch S. et al. Red blood cell deplition of umbilical cord blood for transplantation// Blood.- 1993.- Vol.82.- Suppl.1.- P.393a.
74) Вязьмин А.Я., О.В. Семикозов, О.В. Озерников, В.А. Карнаухов, В.Г. Герман, Т.Е. Курильская, А.А. Рунович; КОМПЛЕКСНОЕ ЛЕЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ПАРОДОНТИТА С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕТАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ, тезис, Кафедра ортопедической стоматологии Иркутского государственного медицинского университета.
75) Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, Frolova GP . Heterotopic of bone marrow.Analysis of precursor cells for octeogenic and hematopoeietic tissue; Transplantation 1968, v..6: P.230-47.
76) Shamblott M.J.,J. Gaerhart et al.Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells; Proc.Natl.Acad.Sci.US; 1998,v.95, P.13726-31.
77) Thomson J. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocyst; Science; 1998,v.282, P.1145-47.
78) Моисеев АЯ, Самарин ДМ, Кустов СМ и др. Опыт применения трансплантационной фетальной терапии в гинекологической практике при лечении рубцово-спаечных процессов. Бюлл. Эксп.Биол.Мед. 1998, 126 Прилож 1:129.
79) Рабинович СС, Тарабан ВЯ, Повещенко ОВ и др. Возможности трансплантационного лечения спинномозговых травм. Материалы 2 Межрегиональной научно-практической конференции (г.Омск, 27-28 июня 2000 г.): 142-147.
80) Рунович АА, Курильская ТЕ, Никифоров СБ и др.: Эффективность фетальной терапии в комплексном лечении ишемической болезни сердца. Материалы 2 Межрегиональной научно-практической конференции (г.Омск, 27-28 июня 2000 г.): 76-80.
81) Стрункин ДН, Самарин ДМ, Сидоров СВ. Трансплантация кроветворных фетальных клеток в лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Материалы 2 Межрегиональной научно-практической конференции (г.Омск, 27-28 июня 2000 г.): 194-195.
82) Шумаков В.И., Блюмкин В.И., Скалецкий Н.Н. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы. М.: 1995.
83) Mei-Hui Tai, Chia-Cheng Chang, L. Karl Olson, and James E. Trosko. Oct4 expression in adult human stem cells: evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis. Carcinogenesis doi:10.1093/carcin/bgh321.
84) Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 2004; 432: 396-401.
85) Rubio D, Garcia-Castro J, Martin MC, et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res 2005; 65: 3035–9.
86) Adult stem cells and cancer. Cancer Res 2005; 65: 9601.
87) Берсенев А.В. Новые данные по спонтанной онкогенетическая трансформации взрослых стволовых клеток костного мозга человека in vitro, Клеточные технологии, 13,12 2005.
88) Miura M, Miura Y, Padilla-Nash HM, et al. Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stemcells leads to malignant transformation. Stem Cells 2005 Nov 10; Epub.
89) Bohl J.: Goebel H.H., Potsch L et si. Complications following cell therapy. Z Rechtsmed 1S89; 103-1 J: 1. 9. Barrett S.
90) Baccarani U, Adani G.L, Sanna A. et al. Portal vein thrombosis after
intraportal hepatocytes transplantation in a liver transplant recipient,
Transpl Int 2OO5; 18[6): 750.
91) Берсенев А.В. Причины осложнений, связанных с лабораторной
техникой, при трансплантации аутологичных стволовых клеток.
http://oalltranspl.ru/jouma I/news/?MESSAGES[1]=SH0W_NEWSB.NEWS_ID-533.
92) Young-Sup Yoon, Park J.S., Tkebuchava T, et al. Unexpected severe
calcification after transplantation of bone marrow cells in acute
myocardial infarction Ore 0004; 109: 3154.
93) Hashimoto, Jin H. Liu T. et al. Bone marrow-derived progenitor cells
in pulmonary fibrosis. J Clin Invest 20G4: 113: 243.
94) Vulliet PR,, Greeley M.. Hslloran S.M. et a), lntra-согопэгу arterial
injection of mesenchymal stromal cells and microinf a ration in dogs.
Lancet 2004; 363: 783.

ЗОЛОТОЕ ЗДОРОВЬЕ

Стволовые клетки и их использование в современной клинической практике